The interaction between immune competence and stress responses in relation to fish health problems in aquaculture. Deel II: "Modulatory effects of stress on the genetically determined disease resistance of common carp"

Projectleider: prof.dr. W.B. van Muiswinkel
Onderzoeker: ir. J.P.J. Saeij
Projectperiode: januari 1998 ľ april 2002

Samenvatting resultaten (korte inhoud proefschrift )
Een kwart van de totale hoeveelheid vis en schelpdieren, die door de mens geconsumeerd wordt, is momenteel afkomstig uit de aquacultuur. Men verwacht bovendien dat het aandeel van de aquacultuur met de tijd nog verder zal toenemen. De wereldwijd toegenomen vraag naar vis en schelpdieren heeft geleid tot een verdere intensivering van de aquacultuur met het onvermijdelijke effect dat de vissen gevoeliger worden voor ziekten. Een belangrijke factor die leidt tot deze vatbaarheid is stress, ge´nduceerd door de hoge dichtheden, transport, het regelmatig hanteren en de slechte waterkwaliteit, die vaak samengaat met de intensieve aquacultuur. De Wereld Gezondheidsorganisatie (WHO) tracht preventieve maatregelen zoals vaccinatie, genetische selectie en het gebruik van voedseladditieven te stimuleren om ziekte-uitbraken in de aquacultuur in de toekomst te voorkomen. Essentieel voor deze benaderingen zijn experimentele infectiemodellen, die de doeltreffendheid van deze maatregelen kunnen testen.

Trypanoplasma borreli en Trypanosoma carassii zijn beiden protozoaire extracellulaire parasieten van vissen, behorend tot de groep der kinetoplastiden. De kinetoplastiden omvatten een aantal parasieten die erg belangrijk zijn voor de mens, bijvoorbeeld Trypanosoma brucei (slaapziekte), Leishmania s pp. (leishmaniasis), Trypanosoma cruzi (ziekte van Chagas). Zowel T. borreli als T. carassii worden overgebracht door bloedzuigers en infecteren karperachtigen, de belangrijkste vissoorten in de zoetwater aquacultuur. Infectie van karpers met deze parasieten is een voortreffelijk model voor vergelijkende studies aan gastheer-parasiet interacties met een duidelijke relevantie voor de problemen waarmee de hedendaagse aquacultuur geconfronteerd wordt.
Genetische selectie voor ziekteresistentie kan een duidelijke bijdrage leveren aan preventie. EÚn manier om gen-regionen, die ziektegevoeligheid van vissen tegen parasieten bepalen, te identificeren is het gebruik te maken van kandidaatgenen. Deze aanpak maakt gebruik van bekende typen van reacties, die van belang zijn voor de ontwikkeling van aangeboren en verkregen immuniteit.

De sequentie van een kandidaatgen: het natuurlijke resistentie-geassocieerd macrofaag eiwit (NRAMP) van de karper wordt beschreven. Dit eiwit is waarschijnlijk een transportmolecuul voor metalen. Metalen zoals ijzer zijn essentiŰle voedingsstoffen voor parasieten. Daarom kan het reduceren van de beschikbaarheid van ijzer een belangrijk onderdeel zijn van de verdedigingsstrategie van de gastheer. Bovendien treedt ijzer op als een katalysator bij de aanmaak van moleculen zoals hydroxyl radicalen (OHĽ), die fungeren als toxische stof bij de verdediging tegen intracellulaire parasieten.

De DNA-sequentie van een tweede kandidaatgen: induceerbaar stikstofoxide synthase (iNOS) wordt beschreven. Niet alleen zuurstof- maar ook stikstofradicalen geproduceerd door fagocyten kunnen als toxische stoffen fungeren. Daardoor vormen ze een belangrijk aangeboren afweermechanisme tegen ziekteverwekkers. Trypanoplasma borreli of bacteriŰle celwandproducten induceerden iNOS expressie in karper kopnier fagocyten hetgeen leidde tot de productie van grote hoeveelheden van het stikstofoxide (NO) radicaal. Het in vitro door deze cellen geproduceerde NO bleek cytotoxisch te zijn voor de parasiet.

Karpers ge´nfecteerd in vivo met T borreli produceren grote hoeveelheden NO. De productie van toxische moleculen zoals NO is potentieel gevaarlijk. Overproductie van deze toxische moleculen kan tot weefselschade in de gastheer leiden. Inderdaad leidde de remming van NO productie in vivo tot een hogere in plaats van een lagere overleving van ge´nfecteerde karpers. Een mogelijke verklaring voor de schadelijke effecten van NO in vivo is de observatie dat, tenminste in vitro, NO de celdeling van karper lymfocyten kan remmen.

Interessant genoeg induceerde T carassit geen productie van NO, in duidelijke tegenstelling tot T borreli. Lymfocyten bleken veel gevoeliger voor de cytostatische effecten van NO dan de fagocyten. Dit verschil kan worden toegeschreven aan het feit dat lymfocyten lagere niveaus van de meest belangrijke cellulaire antioxidant glutathion (GSH) bevatten. Bovendien hadden lymfocyten vergeleken met fagocyten lagere niveaus van enkele sleutelenzymen betrokken bij het constant houden van GSH concentraties.

Vervolgens worden twee DNA-sequenties voor karper tumor necrose factor alpha (TNFa) wat als een derde kandidaatsgen voor ziekteresistentie in vis kan worden beschouwd, beschreven. lnderdaad kon een polymorfisme in karper TNFa geassocieerd worden met weerstand tegen de parasiet. TNFa is een cytokine dat voornamelijk door fagocyten wordt geproduceerd als antwoord op infectie, ontsteking en andere fysiologische reacties. In vitro kon T borreli de expressie van TNFa induceren. Dit leidde tot de productie van NO door fagocyten en de proliferatie van leukocyten.
Om de precieze rol van fagocyten in de immunologische afweer tegen T borreli te onderzoeken hebben we een techniek toegepast om karpers /i>in vivo van macrofagen te ontdoen. Deze dieren werden gevoeliger voor opportunistische bacteriŰn. Als ze werden ge´nfecteerd met bloedflagellaat parasieten was er echter slechts een lichte stijging in parasitaemia, hetgeen Iaat zien dat macrofagen geen beslissende rol spelen in de resistentie tegen T borreli of T carassii.

Karpers die een infectie met T borreli overleven zijn resistent tegen herinfectie gedurende meer dan 12 maanden. Deze verkregen resistentie bleef intact, wanneer de dieren van hun macrofagen ontdaan werden. De belangrijkste immunogene moleculen van T borreli zijn eiwitten (waarschijnlijk membraan koolhydraateiwitten) en CpG DNA motieven. Wij hebben gevonden dat karpers ge´nfecteerd met T borreli de expressie van de ontstekingscytokinen TNFa en interleukine (IL)-1▀ al vroeg tijdens de infectie verhogen.
Pas tijdens een latere fase werd een toename van de acute fase eiwitten (serum amyloid A, complement factor 3 en alpha-2-macroglobuline) gezien. Infectie met T borreli induceerde een niet-specifieke proliferatie van lymfocyten waarschijnlijk via de inductie van TNFa en IL-▀ leidend tot de productie van parasiet-aspecifieke antilichamen. Echter, laat tijdens de infectie produceren trypanotolerante karpers specifieke antilichamen die samen met complement T borreli lyseren. Stress, opgelegd door dagelijks hanteren, tastte de resistentie van karpers tegen T borreli ernstig aan. Dit effect werd waarschijnlijk veroorzaakt door cortisol. Aangetoond kon worden dat toevoeging van cortisol in vitro de expressie van T borreli-ge´nduceerd IL▀, TNFa, SAA en iNOS remde. Cortisol induceerde ook apoptose van lymfocyten, maar niet van fagocyten. EÚn van de eerste metabole veranderingen tijdens cortisol-ge´nduceerde apoptose was een depletie van GSH in de cel. Omdat GSH een belangrijke rol speelt in de protectie van NO-ge´nduceerde remming van proliferatie van lymfocyten, kan cortisol gestresste dieren gevoeliger maken voor de immunopathologische effecten van NO.

Concluderend kan gezegd worden, dat infectie van karpers met bloodflagellaten een uitstekend model is voor vergelijkende studies aan gastheer-parasiet interacties. De evaluatie van de modulerende effecten van stress op de immuunrespons tegen dit type ziekteverwekkers kan belangrijke informatie verschaffen met een duidelijke relevantie voor de ziekteproblemen, waar de intensieve dierlijke productiesystemen mee te maken hebben.